菲羅門(mén)技術(shù)部電話日常：
— 我（ 董麗華）：您好，菲羅門(mén)技術(shù)部，請(qǐng)問(wèn)有什么可以幫助您？
— 客戶：新柱子，測(cè)出來(lái)的柱效咋這么低？柱子是不是有問(wèn)題？腫么回事？
我內(nèi)心：“聽(tīng)，那是心碎的聲音。死亡三聯(lián)問(wèn)，擊碎了我弱小脆弱的心。突然想到，與其每次授人以魚(yú)，不如借此平臺(tái)授人以漁?！?/span>
言歸正傳嘍
首先，常識(shí)是：新色譜柱拿到手里，一定要進(jìn)行色譜柱效能測(cè)試。這樣，先判斷這根色譜柱是否是合格品，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是，及時(shí)測(cè)試柱效后發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。
一經(jīng)核實(shí)，可向廠家提出退換貨。一旦色譜柱正常使用，后續(xù)再出現(xiàn)問(wèn)題，用戶很難向廠家申請(qǐng)到退換貨的。所以，做新柱子的性能測(cè)試，可以保證您的利益。
我們先來(lái)了解下色譜柱效能評(píng)價(jià)（以下以反相色譜柱作為例子）
一、反相色譜柱評(píng)價(jià)條件
對(duì)于一根填充柱來(lái)說(shuō)，最基本的柱性能評(píng)價(jià)指標(biāo)是柱效和峰對(duì)稱的測(cè)定。反相色譜柱評(píng)價(jià)所需常用的流動(dòng)相一般是甲醇或者乙腈與水的體系，對(duì)于含有酸堿性組份的樣品，流動(dòng)相為甲醇或者乙腈與緩沖鹽的體系；檢測(cè)波長(zhǎng)一般在254nm下檢測(cè)，因?yàn)樵诖瞬ㄩL(zhǎng)處，甲醇、乙腈，磷酸緩沖鹽均沒(méi)有紫外吸收，而且標(biāo)準(zhǔn)樣品多為含苯環(huán)的物質(zhì)，在254nm波長(zhǎng)紫外吸收強(qiáng)，選擇此波長(zhǎng)檢測(cè)可以避免流動(dòng)相戲外吸收的干擾；柱溫一般在室溫下測(cè)定，均不超過(guò)30℃；對(duì)于通常的標(biāo)準(zhǔn)柱型，即Φ4.6mm×250mm的柱子來(lái)說(shuō)，流速以1ml/min為宜。
柱壓則為實(shí)測(cè)值，它不僅與色譜柱有關(guān)，而且取決于流動(dòng)相，以及評(píng)價(jià)色譜柱的溫度與流速。
二、反相色譜柱評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
通常,以指定的一組標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)為樣品,測(cè)定它們?cè)谥由系睦碚撍鍞?shù)，以作為柱效的衡量指標(biāo)。這種標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)的選擇，因不同的色譜模式而異，也因不同的使用目的而有所不同。一般情況下，僅選用3-4中中性，例如芳香烴，最多選用5種。要求它們具有不同的保留因子（例如，第一個(gè)化合物k=0，其余的在2～10范圍內(nèi)），能反映出對(duì)柱子性質(zhì)的基本要求，而且能在一般的HPLC裝置上得到清晰的信號(hào)。反相色譜柱評(píng)價(jià)所用的標(biāo)準(zhǔn)樣品各不相同，
采用NaNO3,NH2NO3，尿嘧啶，硫脲等作為樣品，進(jìn)行死時(shí)間的測(cè)定，一般可得較近的結(jié)果。雖然很多資料證實(shí)尿嘧啶有保留，但因其峰型相對(duì)較好等原因一直得到廣泛得應(yīng)用。
衡量柱效的物質(zhì)則千差萬(wàn)別，由苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等，一般以最后洗脫出的組分衡量柱效（可以弱化死體積的影響外，同時(shí)與色譜柱填料充分接觸）。
衡量色譜柱分離堿性樣品的柱效，不對(duì)稱度，可用阿米替林。
三、可能的影響柱效的因素（除色譜柱本身）
這里我們先不談峰的對(duì)稱性，當(dāng)峰不對(duì)稱的時(shí)候，柱效一定低的，我們暫時(shí)只考慮柱效低的影響因素有哪些。
柱外效應(yīng)是指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的成因，從進(jìn)樣系統(tǒng)到檢測(cè)器之間色譜柱以外流路部分，主要由進(jìn)樣裝置、檢測(cè)池及它們與柱之間的連接管路所產(chǎn)生，并對(duì)柱效能產(chǎn)生的影響。
進(jìn)樣裝置的影響：例如手動(dòng)進(jìn)樣，樣品注射的速度影響樣品的擴(kuò)散范圍大小，使峰展寬，影響柱效。
檢測(cè)池的影響：檢測(cè)池體積大，使樣品被流動(dòng)相稀釋，不僅會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，還使峰展寬。除了池體積大小的影響外，池的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（幾何形狀）和池內(nèi)的流動(dòng)特性（從連接管到樣品池由于直徑變化引起的）都會(huì)影響峰展寬。假如樣本同時(shí)達(dá)到檢測(cè)池，通過(guò)縱向和橫向擴(kuò)散，在檢測(cè)池中擴(kuò)散的范圍極端值為檢測(cè)室的體積。所以池體積小，峰展寬會(huì)小。目前使用的檢測(cè)池體積大多數(shù)都小于等于8μL，對(duì)于常規(guī)分析一般沒(méi)有多大影響。另外，當(dāng)使用小體積高效柱時(shí)，故希望檢測(cè)池體積小于5μL，微量色譜柱的體積應(yīng)減少到1μL，甚至更小。
連接管對(duì)色譜峰擴(kuò)展的影響，是由于流動(dòng)相在空管中的流動(dòng)速度分布的縱斷面呈拋物線狀，管中心的樣品分子比管壁部分的樣品分子先到達(dá)樣品池，因此引起了峰擴(kuò)展。檢測(cè)池與色譜柱出口的連接，或者幾個(gè)檢測(cè)器之間的連接，應(yīng)采用細(xì)內(nèi)徑連接管并控制最短的距離，以使峰擴(kuò)展最小。但應(yīng)注意，連接管內(nèi)徑減小時(shí)，管內(nèi)壓力降會(huì)有所增加。一般最好使用內(nèi)徑0.1mm(或0.2mm)的不銹鋼或PEEK管,長(zhǎng)度應(yīng)盡可能地短。
題外話：有時(shí)候做方法時(shí)，理論上兩個(gè)物質(zhì)的分離度大于1.5，但實(shí)際最好達(dá)2.0，因?yàn)椴煌瑑x器的樣品池和連接管對(duì)峰擴(kuò)展的貢獻(xiàn)有可能使在色譜柱上已經(jīng)分離了的組分在樣品池中又重疊混合，轉(zhuǎn)移后的方法重現(xiàn)不出。
檢測(cè)器的參數(shù)影響。檢測(cè)器的時(shí)間常數(shù)包括檢測(cè)器傳感器和電子元件的響應(yīng)時(shí)間，它間接對(duì)色譜系統(tǒng)的最小檢測(cè)量和最低檢測(cè)濃度產(chǎn)生影響。一般說(shuō)來(lái)，傳感器的響應(yīng)較快。而檢測(cè)器放大器和記錄儀的時(shí)間常數(shù)有可能過(guò)大，使色譜峰變形失真，導(dǎo)致柱效下降，也影響色譜分析的可靠性和準(zhǔn)確性。目前使用的檢測(cè)器和記錄儀的時(shí)間常數(shù)一般在0.5s-1.0s 就是合適的。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與進(jìn)樣體積的影響。用兩個(gè)極端（正常至超載連續(xù)圖）的例子，用柱效的數(shù)學(xué)來(lái)解釋原理。N=16(tR/W)2.其中tR是保留時(shí)間；W為峰寬。
左圖：樣品質(zhì)量對(duì)峰寬和峰型的影響,峰1到峰4，進(jìn)樣質(zhì)量逐漸增大。
右圖：樣品體積對(duì)峰寬和峰型的影響,峰1到峰4，進(jìn)樣體積逐漸增大。
上面的圖顯示，隨著樣品質(zhì)量和體積的增大，W增大的程度遠(yuǎn)大于tR增量，所以tR/W總比值是變小的，此比值與柱效呈正相關(guān)，所以柱效會(huì)下降。
四、總結(jié)
通過(guò)上述的講解，大家有沒(méi)有明白柱效為什么會(huì)降低呢？有沒(méi)有體會(huì)到擁有“漁技”的快樂(lè)？有沒(méi)有內(nèi)心從容一些？
色譜柱在出廠的過(guò)程中有專門(mén)優(yōu)化過(guò)的機(jī)器來(lái)進(jìn)行色譜柱測(cè)試性能，各方面條件和現(xiàn)實(shí)中是有差異。所以新購(gòu)來(lái)的柱子在實(shí)驗(yàn)室中所測(cè)得的柱效，往往低于生產(chǎn)廠家給出的柱效。
色譜柱測(cè)試時(shí)，可以根據(jù)廠家隨柱附帶的測(cè)試報(bào)告來(lái)測(cè)試。當(dāng)然，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的要求配制自己的標(biāo)準(zhǔn)溶質(zhì)。
我們技術(shù)部建議：第一次柱測(cè)試，最好和廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)圖相比較，選用與廠家相同的測(cè)試條件，有可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)。
1. 常規(guī)HPLC色譜柱，數(shù)值超過(guò)柱報(bào)告柱效上70%，則屬于合格品。
2. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與進(jìn)樣體積，請(qǐng)向廠家詢問(wèn)清楚。
3. 測(cè)試物質(zhì)選取的不同，作用也是不同的。對(duì)于柱效這個(gè)參數(shù)，一般測(cè)定混合物的較靠后面的峰的數(shù)值作為比較標(biāo)準(zhǔn)。
4. 在HPLC儀器上測(cè)試內(nèi)徑小于3mm的色譜柱時(shí)，柱效這個(gè)數(shù)據(jù)已經(jīng)不準(zhǔn)確，這個(gè)時(shí)候要關(guān)注出峰時(shí)間是否與柱報(bào)告上的物質(zhì)相近（管路長(zhǎng)短、寬窄引起時(shí)間微小差異），峰是否變形。最好UHPLC儀器來(lái)測(cè)定UHPLC的小粒徑小體積柱。
菲羅門(mén)技術(shù)熱線：020-22826668-819，歡迎交流
