HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：溶解度
我們分析了注射和分離過程中需要多少緩沖液才能有效緩沖樣品和色譜柱。
與此同時(shí)，還存在一個(gè)問題：使用上限是多少呢？
這里應(yīng)注意一個(gè)關(guān)鍵問題：避免系統(tǒng)中產(chǎn)生緩沖液沉淀。
如果緩沖液在HPLC泵中產(chǎn)生沉淀，則需要大量的清潔工作才能將其清除，還需要更換部件。
而且，如果緩沖液在色譜柱內(nèi)部產(chǎn)生沉淀，則應(yīng)丟棄色譜柱，因?yàn)閹缀鯚o(wú)法從固定相的孔中清洗沉淀的緩沖液。
正如分析人員所熟知的那樣，對(duì)于緩沖液和鹽溶劑來說，乙腈（ACN）的效果比甲醇（MeOH）要差得多，而四氫呋喃（THF）則更差。
表3的數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示了這一點(diǎn)，在pH為7.0時(shí)，可溶性最差的常見緩沖液是磷酸鉀[2]。
當(dāng)有機(jī)物為80%，溶于MeOH中的磷酸鹽濃度為15mM，但在ACN中的濃度只有5mM；在80％THF中幾乎不溶（<5mM）。
在含有50％有機(jī)物的流動(dòng)相中，磷酸鹽可溶于MeOH或ACN（其濃度>50mM），以及THF（25mM）。
也就是說，在等度分離時(shí)使用高有機(jī)物（％B）流動(dòng)相或梯度結(jié)束在高％B。
必須注意避免緩沖液產(chǎn)生沉淀。
表3. pH為7.0時(shí)磷酸鉀在普通HPLC溶劑1中的溶解度
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%B |
MeOH |
ACN |
THF |
|
502 |
>50 mM |
>50 mM |
25 mM |
|
60 |
>50 |
45 |
15 |
|
70 |
35 |
20 |
10 |
|
80 |
15 |
5 |
<5 |
|
90 |
5 |
0 |
0 |
表3所示的數(shù)據(jù)適用于本體溶液。
在線混合的效果可能會(huì)更差。無(wú)論是使用高壓混合還是低壓混合HPLC系統(tǒng)，當(dāng)溶劑進(jìn)入混合器時(shí)，A和B溶劑都會(huì)直接充分接觸。
這可能會(huì)產(chǎn)生其它一些意外情況。鑒于這種情況，便需要含有10mM緩沖液的60％ACN流動(dòng)相，這比表3中所示的60％ACN的45mM臨界濃度要低得多。
如果A容器含有25mM緩沖液且B容器含有100％ACN，則A與B以40/60比例混合時(shí)，應(yīng)足以滿足所需的流動(dòng)相。
但是，混合溶劑時(shí)，100％ACN接觸25mM緩沖液后，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。
這可能造成很多問題，或者沉淀物也許會(huì)迅速重新溶解，具體取決于設(shè)備的設(shè)計(jì)特點(diǎn)。
所選的鹽也會(huì)使溶解度出現(xiàn)顯著的差異。
如表4所示，在可比條件下，磷酸銨鹽在ACN中比鉀鹽更容易溶解。
醋酸鹽比磷酸鹽更易溶解。通常，考慮到溶解度的差異，最好使用鉀鹽而非鈉鹽。
表4. 不同緩沖液溶于乙腈的溶解度1
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%B |
醋酸銨 pH5.0 |
磷酸銨 pH3.0 |
磷酸鉀 pH 3.0 |
磷酸銨 pH7.0 |
磷酸鉀 pH7.0 |
|
602 |
>50 mM |
>50 mM |
>50 mM |
50 mM |
45 mM |
|
70 |
>50 |
>50 |
>50 |
25 |
20 |
|
80 |
>50 |
35 |
20 |
5 |
0 |
|
90 |
25 |
5 |
0 |
0 |
0 |
1 [2]的數(shù)據(jù)；2 當(dāng)%B更低時(shí)，溶于所有溶劑的濃度>50 mM
